新冠病毒（SARS-CoV-2）感染的临床阐扬千般，从无症状到致命的呼吸穷乏都有。尽管在康复个体中可携带产生功能性的新冠病毒特异性 CD8+ T 细胞反馈，但病毒特异性 CD8+ T 细胞反馈在适度新冠病毒复制方面的作用仍不解确。在本量度中，咱们发现，在食蟹猴中，即使莫得 CD8+ T 细胞，亚急性的新冠病毒复制也能得到适度。八只食蟹猴经鼻内接种了 10⁵或 10⁶半数组织培养感染剂量（TCID50）的新冠病毒，其中八只食蟹猴中的三只在感染后的第 5 天和第 7 天招揽了单克隆抗 CD8 抗体拯救。在这三只食蟹猴中，从第 7 天及以后都检测不到 CD8+ T 细胞，而在其余五只未招揽拯救的动物中携带出了病毒特异性 CD8+ T 细胞反馈。在统共食蟹猴中，感染后 10 至 17 天在鼻咽拭子中都检测到了病毒 RNA，何况抗 CD8 抗体拯救组和未拯救组动物的咽拭子中病毒 RNA 水平的变化情况以及血浆中庸抗体滴度十分。在未拯救组的两只食蟹猴中，在第 21 天尸检时获取的咽黏膜和 / 或咽后淋夤缘中检测到了新冠病毒 RNA，但在统共招揽抗 CD8 抗体拯救的食蟹猴中均未检测到。CD8+ T 细胞反馈可能有助于适度新冠病毒感染中的病毒，但咱们的后果标明，在莫得 CD8+ T 细胞的情况下，亚急性病毒复制也有可能得到适度，这意味着 CD8+ T 细胞功能阻遏可能并非导致病毒适度失败的唯独原因。

新冠病毒感染的临床阐扬领域很广，从无症状到致命的呼吸穷乏都有。病毒适度失败和 / 或致命疾病进展的决定身分尚未王人备敷陈。取得性免疫效应因子，即抗体和 CD8+ T 细胞，都被觉得有助于病毒适度。但是，这两个方面中任何一个的瑕玷是否与适度新冠病毒复制的失败平直关系仍不昭彰。在本量度中，为明晰解感染建造后适度病毒对 CD8+ T 细胞的需求，咱们量度了在亚急性期予以单克隆抗 CD8 抗体耗竭 CD8+ 细胞对食蟹猴中新冠病毒复制的影响。出乎料思的是，咱们的分析透露，耗竭 CD8+ 细胞对病毒复制莫得显赫影响，这标明在莫得 CD8+ T 细胞的情况下，亚急性的新冠病毒复制也能得到适度。CD8+ T 细胞反馈可能有助于适度新冠病毒感染中的病毒，但这项量度标明，CD8+ T 细胞功能阻遏可能并非导致病毒适度失败或致命疾病进展的唯独原因。

一、序文

由严重急性呼吸抽象征冠状病毒 2（SARS-CoV-2）引起的 2019 冠状病毒病（COVID-19）已飞速传播，导致了一场要紧的大流行。SARS-CoV-2 通过呼吸谈传播，从感染到症状出现的平均暗藏期臆想为 5 天。SARS-CoV-2 感染的临床阐扬领域很广，从无症状到致命的呼吸穷乏都有。多种混杂身分，如年事和基础疾病，都与 COVID-19 的严重经由关系。举例，据报谈，针对 I 型打扰素的自己抗体与危及人命的 COVID-19 肺炎联系。但是，病毒适度失败和 / 或致命疾病进展的信得过决定身分尚未王人备敷陈。

大无数非致命的 COVID-19 病例在咽拭子中可检测到病毒产生的时辰有限，在感染后苟简一周达到峰值。宿主的取得性免疫反馈以及先天性免疫反馈都参与了病毒复制的适度。大无数受感染个体都会携带产生抗 SARS-CoV-2 中庸抗体。最近的临床量度，包括那些对于康复期血浆和 / 或单克隆抗体给药的量度，仍是标明中庸抗体对 SARS-CoV-2 感染的灵验性。动物量度仍是阐明了中庸抗体在体内对感染的灵验性。此外，在大无数非致命的 COVID-19 病例中也会携带产生 SARS-CoV-2 特异性 T 细胞反馈。现在的量度标明，在康复的 COVID-19 个体中会携带产生功能性的病毒特异性 CD8+ T 细胞反馈，这意味着 CD8+ T 细胞对 SARS-CoV-2 复制有遏止作用。因此，取得性免疫效应因子，即抗体和 CD8+ T 细胞，都被觉得有助于病毒适度。但是，这两个方面中任何一个的瑕玷是否与适度 SARS-CoV-2 复制的失败平直关系仍不昭彰。据报谈，患有无丙种球卵白血症的 COVID-19 患者适度住了疾病进展，这标明即使在莫得抗体反馈的情况下也能适度病毒。

先前一项在恒河猴再次感染前予以抗 CD8 抗体的量度标明，CD8+ T 细胞对防护 SARS-CoV-2 再次感染有部分作用。但是，在感染建造后适度病毒复制对 CD8+ T 细胞的需求仍不昭彰。在本量度中，咱们量度了在亚急性期予以单克隆抗 CD8 抗体耗竭 CD8+ 细胞对食蟹猴中 SARS-CoV-2 复制的影响。出乎料思的是，咱们的分析透露，耗竭 CD8+ 细胞对病毒复制莫得显赫影响，这标明在莫得 CD8+ T 细胞的情况下，亚急性的 SARS-CoV-2 复制也能得到适度。

二、后果

01. 食蟹猴经鼻内接种后 SARS-CoV-2 感染的动态变化

先前的量度标明，用 10⁵半数组织培养感染剂量（TCID50）的 SARS-CoV-2 进行鼻内仁爱管内接种会导致恒河猴感染，感染后一周以上在咽拭子中仍可检测到病毒 RNA。在本量度中，咱们最初量度了仅鼻内接种 SARS-CoV-2 是否能导致食蟹猴感染。在第一个现实中，食蟹猴经鼻内接种了 10⁶（在食蟹猴 N011 中信得过为 7.5×10⁵）、10⁵（在食蟹猴 N012 和 N013 中信得过为 7.5×10⁴）或 10⁴（在食蟹猴 N014 中信得过为 7.5×10³）TCID50 的 SARS-CoV-2（表 1）。食蟹猴 N011、N012 和 N013 在第 2 天，即峰值时，鼻咽拭子中的病毒 RNA 水平通常（图 1A）。在喉拭子中也检测到了病毒 RNA，峰值较低（图 1B）。在病毒接种后，鼻咽拭子中的病毒 RNA 苟简可检测两周（最长：N011 中到第 17 天，N012 中到第 12 天，N013 中到第 14 天）（图 1A、1C 和 1D）。在鼻咽拭子和喉拭子中也检测到了亚基因组 RNA（sgRNA），标明病毒在复制（图 2A 和 2B）。在 N011 的鼻咽拭子中直到第 9 天、N012 中直到第 7 天、N013 中直到第 5 天都检测到了 SARS-CoV-2 sgRNA（图 2A、2C 和 2D）。但是，在接种了 10⁴ TCID50 SARS-CoV-2 的食蟹猴 N014 中，未检测到 sgRNA，何况仅在鼻咽拭子中直到第 5 天检测到了病毒 RNA，尽管水平较低（图 1A 和 2A），这标明 10⁴ TCID50 低于能握续携带可检测到的病毒复制的病毒接种阈值。随后，N014 被排斥在进一步的分析除外。

图1. 拭子中的病毒 RNA 水平。（A-D）统共动物（A、B）或感染了 10⁶（C）或 10⁵（D）TCID50 SARS-CoV-2 的动物感染 SARS-CoV-2 后，鼻咽拭子（A、C、D）和喉拭子（B）中病毒 RNA 水平的变化。检测下限约为每拭子 3×10³ 拷贝。（E）比较感染 10⁶ TCID50 和 10⁵ TCID50 SARS-CoV-2 的食蟹猴在感染后第 5 天鼻咽拭子中的病毒 RNA 水平。未不雅察到显赫各别。（F）比较感染 10⁶或 10⁵ TCID50 SARS-CoV-2 的 N 组和 D 组动物在感染后第 5 天（左）、第 7 天（中）和第 9-12 天（右）鼻咽拭子中的病毒 RNA 水平。未不雅察到显赫各别。

图2. 拭子中的病毒亚基因组 RNA 水平。统共动物（A、B）或感染了 10⁶（C）或 10⁵（D）TCID50 SARS-CoV-2 的动物感染 SARS-CoV-2 后，鼻咽拭子（A、C、D）和喉拭子（B）中病毒 sgRNA 水平的变化。检测下限约为每拭子 3×10³ 拷贝。

在第二个现实中，两只（N021 和 D023）和三只（N022、D024 和 D025）食蟹猴分辨经鼻内接种了 10⁶和 10⁵ TCID50 的 SARS-CoV-2（表 1）。五只食蟹猴中的三只（D 组中的 D023、D024 和 D025）在第 5 天和第 7 天静脉打针了单克隆抗 CD8 抗体。与第一个现实中接种 10⁶或 10⁵ TCID50 SARS-CoV-2 的三只食蟹猴比拟，第二个现实中的五只食蟹猴在第 2 天鼻咽拭子中的病毒 RNA 和 sgRNA 水平十分（图 1A 和 2A）。本色上，在第一个现实的前三只和第二个现实的后五只动物之间，第 5 天鼻咽拭子中的 RNA 水平莫得显赫各别（图 1E）。在接种 10⁶（n = 3）和 10⁵（n = 5）TCID50 SARS-CoV-2 的食蟹猴之间，在第 2 天和第 5 天，无论是鼻咽拭子照旧喉拭子中的病毒载量都莫得彰着各别（图 1C、1D、2C 和 2D）。在接种后，N021 的鼻咽拭子中直到第 14 天、N022 的直到第 10 天都检测到了病毒 RNA（图 1A、1C 和 1D）。在接种后，N021 的鼻咽拭子中直到第 5 天、N022 的直到第 7 天都检测到了 SARS-CoV-2 sgRNA（图 2A、2C 和 2D）。总之，在第一个和第二个现实中，用 10⁶或 10⁵ TCID50 的 SARS-CoV-2 经鼻内接种食蟹猴会导致病毒复制，在鼻咽拭子中可检测到病毒 RNA 的时辰为 10 至 17 天。

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表1. 食蟹猴现实决策。

02.CD8+ 细胞耗竭后 SARS-CoV-2 感染的动态变化

然后，咱们量度了 CD8+ 细胞耗竭对 SARS-CoV-2 感染亚急性期病毒复制的影响。在第 5 天和第 7 天招揽抗 CD8 抗体拯救的三只 D 组食蟹猴中，从第 7 天及以后在外周血中检测不到 CD8+ T 细胞（图 3）。与五只未拯救的 N 组食蟹猴比拟，这三只食蟹猴在抗 CD8 抗体拯救前（第 5 天）和拯救后（第 7 天）鼻咽拭子中的病毒 RNA 水平十分（图 1F）。在病毒接种后，D025 的鼻咽拭子中直到第 10 天、D023 和 D024 的直到第 14 天都检测到了病毒 RNA（图 1A、1C 和 1D）。在 D023 的鼻咽拭子中直到第 2 天、D024 的直到第 5 天、D025 的直到第 7 天都检测到了病毒 sgRNA（图 2A、2C 和 2D）。总体而言，在三只招揽抗 CD8 抗体拯救的 D 组食蟹猴和五只未拯救的 N 组食蟹猴之间，拭子中的病毒 RNA 水平莫得彰着各别。

图3. 外周血 B 细胞和 T 细胞频率。

食蟹猴感染 SARS-CoV-2 后，外周血单个核细胞（PBMC）中 CD3+%、CD3+CD4+%、CD3+CD8+% 和 CD3-CD20+ T 细胞百分比的变化。

咱们还搜检了是否不错从单个拭子样本平分离出病毒（表 2）。从经鼻内接种 10⁶或 10⁵ TCID50 的统共八只动物的鼻咽拭子和喉拭子中都分离出了 SARS-CoV-2。在未招揽抗 CD8 抗体拯救的食蟹猴中，病毒分离握续 2 至 12 天（N021 中直到第 2 天，N013 和 N022 中直到第 5 天，N011 中直到第 7 天，N012 中直到第 12 天），在招揽抗 CD8 抗体拯救的食蟹猴中握续 2 至 7 天（D024 中直到第 2 天，D023 和 D025 中直到第 7 天）。莫得迹象标明 CD8 细胞耗竭后病毒分离加多。

表2. SARS-CoV-2 感染后从咽拭子平分离病毒。

食蟹猴 N021 在感染后第 14 天安乐死，而其余动物在感染后第 21 天安乐死（表 1）。对体温的搜检透露，一些动物出现了片时的低热（N021 和 D025 中在第 2 天；D023 和 D024 中在第 6 天；N012 中在第 13 至 19 天）（图 S1）。对食蟹猴 N021 在第 14 天尸检时获取的肺进行组织病理学分析，发现存轻度或中度的肺部炎症（图 S2），而在第 21 天对其他动物的肺进行搜检时未检测到彰着的病理变化。

图S1. 猕猴感染前后的体温变化。

图S2. 食蟹猴 N021 的肺部组织病理学。从食蟹猴 N021 在感染后第 14 天尸检时获取的肺部进行苏木精和伊红染色（H&E）的代表性组织病理学图像，透露轻度或中度肺部炎症。在血管和细支气管周围不雅察到单核细胞浸润（左上角图）。在肺泡中不雅察到淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞（右上角和下图）。

从尸检时获取的咽黏膜、咽后淋夤缘（RPLN）、肺、肠谈和脾脏中索求 RNA，并进行逆转录团聚酶链式反馈（RT-PCR）以检测病毒 RNA（表 3）。在食蟹猴 N012、N014、N021、D023 和 D024 的组织中未检测到病毒 RNA。但是，在 N011 的 RPLN 中、N013 的咽黏膜、RPLN 和脾脏中以及 N022 和 D025 的脾脏中检测到了病毒 RNA。此外，在 N013 的咽黏膜、RPLN 和脾脏中也检测到了病毒 sgRNA。莫得把柄标明招揽抗 CD8 抗体拯救的食蟹猴中病毒复制增强。

表3. 尸检获取组织中病毒 RNA 的检测。

03.食蟹猴经鼻内接种 SARS-CoV-2 后的抗体和 T 细胞反馈

统共食蟹猴在经鼻内接种 SARS-CoV-2 后都携带产生了抗 SARS-CoV-2 中庸抗体（NAb）反馈（图 4）。仅在食蟹猴 N021 和 D025 中在第 7 天检测到了 NAb 反馈，而在第 14 天在统共动物中都检测到了。食蟹猴 D025 和 D024 分辨阐扬出最高和最低的 NAb 滴度。在三只招揽抗 CD8 抗体拯救的食蟹猴和五只未拯救的食蟹猴之间，NAb 反馈莫得彰着各别。

图4. SARS-CoV-2 特异性中庸抗体反馈：统共动物（左）或感染了 10⁶（中）或 10⁵（右）TCID50 SARS-CoV-2 的动物感染后血浆中抗 SARS-CoV-2 中庸抗体滴度的变化。

终末，咱们搜检了五只接种了 10⁶或 10⁵ TCID50 SARS-CoV-2 且未招揽抗 CD8 抗体拯救的食蟹猴中针对 SARS-CoV-2 刺突（S）、核衣壳（N）以及膜和包膜（M&E）抗原的 CD8+ T 细胞反馈。在用外周血单个核细胞（PBMC）进行的分析中，在食蟹猴 N013 中未检测到 SARS-CoV-2 特异性 CD8+ T 细胞反馈，但在其余四只食蟹猴中检测到了（图 5A 和 5B）。食蟹猴 N022 在第 7 天阐扬出 CD8+ T 细胞反馈，而其余三只食蟹猴（N011、N012 和 N021）在第 14 天首次出现 SARS-CoV-2 特异性反馈。对尸检时获取的下颌下淋夤缘（SMLN）进行分析发现，在食蟹猴 N011、N013 和 N021 中存在 SARS-CoV-2 特异性 CD8+ T 细胞反馈（图 5C）。酷爱酷爱的是，在食蟹猴 N013 的 PBMC 中未检测到 SARS-CoV-2 特异性 CD8+ T 细胞反馈，但在 SMLN 中检测到了。因此，在五只接种了 10⁶或 10⁵ TCID50 SARS-CoV-2 且未招揽抗 CD8 抗体拯救的 N 组食蟹猴中都检测到了 SARS-CoV-2 特异性 CD8+ T 细胞反馈。终末，在对招揽抗 CD8 抗体拯救的食蟹猴尸检时获取的 SMLN 中阐明了 CD8+ T 细胞耗竭（图 S3）。

图5. SARS-CoV-2 特异性 CD8+ T 细胞反馈：（A）食蟹猴 N012 在感染后第 14 天用重迭的 M&E 肽库刺激后检测 γ 打扰素（IFN-γ）携带的代表性设门决策。（B）感染 10⁶（中）或 10⁵（右）TCID50 SARS-CoV-2 的 N 组动物在感染后第 7 天、第 14 天和第 21 天 PBMC 中针对 S、N 和 M&E 的 CD8+ T 细胞频率。（C）在食蟹猴 N011、N013、N021 和 N022 尸检时获取的下颌下淋夤缘中针对 S、N 和 M&E 的 CD8+ T 细胞频率。食蟹猴 N012 莫得样本可用于分析。

图S3. 尸检时下颌下淋夤缘中 CD8+ T 细胞频率。透露了尸检时获取的下颌下淋夤缘中 CD3+CD8 + 细胞的频率。

三、商讨

据报谈，宿主的 T 细胞和 B 细胞反馈有助于适度 SARS-CoV-2 的复制。在一种感染了适宜小鼠的 SARS-CoV 毒株的小鼠模子中，耗竭 CD4+ T 细胞会导致中庸抗体反馈松开，以及病毒从肺部排除的时辰蔓延。此外，在莫得 CD4+ T 细胞和 B 细胞的情况下，SARS-CoV 的复制得到了适度，这标明 CD8+ T 细胞在病毒适度中阐扬作用。最近对东谈主类的量度标明，在康复的 COVID-19 个体中会携带产生功能性的病毒特异性 CD8+ T 细胞反馈。这些答复标明 CD8+ T 细胞在适度 SARS-CoV-2 复制方面有一定作用。但是，在莫得 CD8+ T 细胞的情况下，SARS-CoV-2 的复制是否能得到适度仍不昭彰。在本量度中，咱们量度了在病毒感染建造后的亚急性期，通过予以抗 CD8 抗体耗竭 CD8+ 细胞（包括 CD8+ T 细胞）对 SARS-CoV-2 复制的影响。咱们对于病毒 RNA 以及从咽拭子平分离病毒的后果（图 2 和表 2）标明，当动物招揽抗 CD8 抗体拯救时，病毒复制并未受到遏止，而在 CD8+ 细胞耗竭后，病毒复制得到了适度。咱们发现，在 CD8+ 细胞耗竭后，病毒复制莫得显赫增强，病毒排除也莫得蔓延，这标明在莫得 CD8+ T 细胞的情况下，亚急性的 SARS-CoV-2 复制也能得到适度。

咱们的发现并不否定 CD8+ T 细胞在适度 SARS-CoV-2 复制方面的作用，也不否定疫苗携带的 CD8+ T 细胞对病毒的保护作用。在本量度中，病毒特异性 CD8+ T 细胞反馈在感染后第 1 周大多检测不到，而在第 2 周不错检测到，这与最近一篇对于 COVID-19 患者发病后急性期 T 细胞反馈的答复一致。因此，CD8+ T 细胞反馈在适度病毒载量峰值方面可能并不起中枢作用，但在初度 SARS-CoV-2 感染后，对适度病毒复制和 / 或疾病进展可能有很大影响。有量度标明 CD8+ T 细胞反馈酬防护再次感染有作用，这意味着疫苗携带的 CD8+ T 细胞反馈可能会在急性期增强对病毒的适度。本量度标明，CD8+ T 细胞功能阻遏与病毒适度失败莫得平直关联，这可能意味着宿主可能存在多种免疫机制参与适度初度 SARS-CoV-2 的复制。

用于分析发病机制和传播以及评估疫苗和抗病毒药物的 SARS-CoV-2 感染动物模子是必要的。非东谈主类灵长类动物模子因其在遗传和生理上与东谈主类通常，被觉得是最具临床关系性的。最近的量度标明，恒河猴和食蟹猴不错感染 SARS-CoV-2，并阐扬出访佛于东谈主类 COVID-19 的临床阐扬。这两种猕猴都呈现出轻度至中度的 COVID-19 症状，这在大无数东谈主类中也能不雅察到。因此，咱们使用食蟹猴的 SARS-CoV-2 感染模子来分析 CD8+ 细胞耗竭对病毒复制的影响。

咱们仅尝试通过鼻内路线接种 SARS-CoV-2，而莫得进行气管内接种，因为这可能更接近东谈主类的病毒传播样貌。鼻咽拭子中病毒 RNA 峰值（第 2 天）的几何平均值为每拭子 2.7×10⁸（领域：1.1×10⁸至 5.2×10⁸）拷贝，sgRNA 峰值的几何平均值为每拭子 1.0×10⁶（领域：1.8×10⁵至 1.8×10⁶）拷贝，这与用 10⁵ TCID50 的 SARS-CoV-2 进行鼻内仁爱管内接种的恒河猴中的情况十分。在用 10⁵ TCID50（1.4×10⁸ RNA 拷贝）的 SARS-CoV-2 接种的猕猴中，第 2 天鼻咽拭子中的病毒 RNA 拷贝数与接种物中的总病毒 RNA 拷贝数十分（N012）或更高（N013、N022、D024 和 D025），这阐明了即使接种 10⁵ TCID50 的病毒，猕猴体内也会发生病毒复制。与五只接种 10⁵ TCID50 的猕猴比拟，三只接种 10⁶ TCID50 的猕猴在第 2 天和第 5 天鼻咽拭子中的病毒 RNA 水平通常。统共八只经鼻内接种 10⁶或 10⁵ TCID50 SARS-CoV-2 的猕猴都产生了灵验的抗 SARS-CoV-2 中庸抗体反馈，何况五只未招揽抗 CD8 抗体拯救的猕猴携带产生了 SARS-CoV-2 特异性 CD8+ T 细胞反馈。要而言之，咱们的后果标明，用 10⁶或 10⁵ TCID50 的 SARS-CoV-2 经鼻内接种食蟹猴会导致咽黏膜中的病毒复制。适度咽黏膜中的病毒复制对于适度病毒的进一步传播以及疾病进展都很进攻。

咱们的食蟹猴仅经鼻内接种 SARS-CoV-2（而非气管内接种）的模子被觉得代表了无症状或轻度的 COVID-19。但是，对肺部的组织病理学分析在一只动物（N021）感染后第 14 天检测到了肺部炎症（图 S2），这标明经鼻内接种 SARS-CoV-2 有激发中度肺部疾病的可能性。其他动物可能在第 14 天也出现了轻度的肺部炎症，到第 21 天时炎症得到了缓解。食蟹猴 N013 阐扬出一种私有的表型，在第 14 天后拭子中检测不到病毒 RNA（图 1D），但在感染后第 21 天咽黏膜和下颌下淋夤缘中的病毒 RNA 水平相对较高（表 3）。在第 21 天，在 PBMC 中检测不到病毒特异性 CD8+ T 细胞反馈，但鄙人颌下淋夤缘中不错灵验地检测到（图 5），这标明咽黏膜中存在局部的病毒复制。

本量度使用的样本量相对有限（三只招揽抗 CD8 抗体拯救的动物和五只未拯救的对照动物）。但是，这三只动物在招揽抗 CD8 抗体拯救前咽拭子中的病毒载量水平通常，何况在 CD8+ 细胞耗竭后病毒载量水平也通常。既莫得不雅察到病毒复制增强，也莫得不雅察到病毒适度蔓延。对于五只未招揽抗 CD8 抗体拯救的猕猴，天然这些反馈的强度和能源学不同，但在统共猕猴中都检测到了 SARS-CoV-2 特异性 CD8+ T 细胞反馈。因此，本量度为咱们的论断提供了饱胀的把柄。

总之，本量度标明，在初度 SARS-CoV-2 感染中，即使莫得 CD8+ T 细胞，亚急性的病毒复制也能得到适度。CD8+ T 细胞反馈可能有助于适度 SARS-CoV-2 感染，但咱们的后果标明，CD8+ T 细胞功能阻遏并不会单独导致病毒适度失败或疾病进展。

四、材料与步伐

01. 伦理声明

动物现的确国度传染病量度所（NIID）进行，在该量度所的动物现实伦理委员会批准后（批准编号：520001），按照日本学术会议制定的《动物现实表率看成指南》中的动物现实指南开展。这些现实适宜《对于在量度中使用非东谈主类灵长类动物的韦瑟罗尔答复》的漠视。每只猕猴都单独饲养在一个笼子里，每天招揽圭臬的灵长类动物饲料和极新生果。病毒接种、采血、鼻咽和喉拭子收罗以及抗 CD8 抗体拯救均在氯胺酮麻醉下进行。猕猴在感染后第 14 天或第 21 天在深度麻醉下通过收罗全血进行安乐死。

02. 动物现实

SARS-CoV-2 wk-521 毒株在 Vero E6/TMPRSS2 细胞中进行培养扩增，并获利以制备病毒接种物储备液。通过检测 Vero E6/TMPRSS2 细胞上的细胞病变效应（CPE）和测定非常滴度来评估病毒感染性。九只食蟹猴（猕猴属，3 至 6 岁）经鼻内接种疏浚储备液的 SARS-CoV-2 wk-521，接种剂量为 10⁶（信得过为 7.5×10⁵）TCID50（1.4×10⁹ RNA 拷贝）（n = 3）、10⁵（信得过为 7.5×10⁴）TCID50（n = 5）或 10⁴（信得过为 7.5×10³）TCID50（n = 1）（表 1）。九只猕猴中的三只（D 组）在感染后的第 5 天和第 7 天静脉打针每千克体重 5 毫克的抗 CD8α 抗体克隆 MT807。在病毒接种前至少五天，在氯胺酮麻醉下将一个袖珍可植入式温度记载仪（DST micro-T；Star-Oddi）植入腹腔内来测量体温。猕猴在感染后第 14 天或第 21 天进行安乐死并进行尸检（表 1）。

03. SARS-CoV-2 RNA 的检测

使用 QIAamp 病毒 RNA 微型索求试剂盒（QIAGEN）从 0.2 毫升的拭子溶液（1 毫升含 2% 胎牛血清 [Cytiva] 的 DMEM 培养基）中索求拭子 RNA，并使用 QuantiTect 探针逆转录团聚酶链式反馈（RT-PCR）试剂盒（Qiagen）和 QuantStudio 5（赛默飞世尔科技）进行及时 RT-PCR 以定量病毒 RNA。拭子 RNA 也使用以下引物进行及时 RT-PCR 以测量病毒亚基因组 RNA（sgRNA）水平 ：SARS2-LeaderF60（5’-CGATCTCTTGTAGATCTGTTCTCT-3’）、SARS2-N28354R（5’-TCTGAGGGTCCACCAAACGT-3’）和 SARS2-N28313Fam（FAM-TCAGCGAAATGCACCCCGCA-TAMRA）。组织 RNA 通过使用 TRIzol Plus RNA 纯化试剂盒（赛默飞世尔科技）从匀浆组织中索求，并进行酚 - 氯仿抽提，然后进行及时 RT-PCR 以检测病毒 RNA。

04. 从拭子平分离病毒

将 10 倍系列稀释的拭子溶液添加到 96 孔板中的 Vero E6/TMPRSS2 细胞中，并在不更换培养基的情况下培养 4 天。通过检测细胞病变效应（CPE）和测定非常滴度来评估病毒的分离情况。病毒滴度大于每拭子 1×10² TCID50 的拭子样本被视为阳性。

05. 抗 SARS-CoV-2 中庸抗体（NAb）反馈的分析

将血浆样本在 56°C 下热灭活 30 分钟。对热灭活后的血浆进行系列两倍稀释，并进行四份平行检测。在每份用于四份平行检测的混杂物中，将 40 微升稀释后的血浆与 40 微升 80 TCID50 的 SARS-CoV-2 wk-521 沿途孵育。在室温下孵育 45 分钟后，将 20 微升该混杂物添加到 96 孔板的四个孔中（每孔 1×10⁴个 Vero 细胞）。三天后，通过检测细胞病变效应（CPE）来评估病毒感染性，以细目非常滴度。检测下限为 1:10。

06. 细胞名义符号物的分析

将全血样本用溶血溶液（BD）惩处，并使用抗 CD3 APC-Cy7（SP34-2；BD）、抗 CD4 FITC（M-T477；BD）、抗 CD8 PerCP（SK1；BD）和抗 CD20 PE（2H7；BD）抗体进行名义染色。简略，对招揽抗 CD8 抗体拯救的动物的全血样本用抗 CD3 APC-Cy7、抗 CD4 PerCP（L200；BD）、抗 CD8 FITC（DK25；富士胶片）和抗 CD20 PE 进行染色。用 BD FACS Canto II 分析染色后的细胞。

07. SARS-CoV-2 抗原特异性 CD8+ T 细胞反馈的分析

如前所述，通过对特定刺激后 γ 打扰素（IFN-γ）携带的流式细胞术分析来测量病毒特异性 CD8+ T 细胞频率。使用 Ficoll-Paque PLUS（Cytiva）通过密度梯度离心从全血中制备外周血单个核细胞（PBMC）。使用 Ficoll-Paque PLUS 通过密度梯度离心从切碎的淋夤缘中制备淋夤缘起原的淋巴细胞。在存在高尔基体阻断剂（莫能菌素，BD）、1 微克 / 毫升的抗 CD28（CD28.2，BD）和 1 微克 / 毫升的抗 CD49d（9F10，BD）的情况下，将细胞与肽库（每种肽的最终浓度大于 0.1 微摩尔）沿途脉冲惩处并共培养 6 小时，肽库使用跳跃 SARS-CoV-2 的 S、N、M 和 E 氨基酸序列的重迭肽组（PM-WCPV-S-1、PM-WCPV-NCAP-1、PM-WCPV-VME-1 和 PM-WCPV-VEMP-1）。使用 CytofixCytoperm 试剂盒（BD）以及抗 CD3 APC-Cy7、抗 CD4 FITC、抗 CD8 PerCP 和抗 IFN-γ PE（4S.B3；BioLegend）进行细胞内 IFN-γ 染色。用 BD FACS Lyric 分析染色后的细胞。流式细胞术分析的代表性设门决策如图 5A 所示。通过从肽特异性刺激后的 IFN-γ+ T 细胞频率中减去非特异性 IFN-γ+ T 细胞频率来预备特异性 T 细胞频率。特异性 T 细胞频率小于 CD8+ T 细胞的 0.03% 被视为阴性。

08. 统计分析

使用 Prism 软件进行统计分析，显赫性设定为 p 值小于 0.05。通过曼 - 惠特尼 U 检会进行比较。

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